Structural insight into T cell coinhibition by PD-1H (VISTA)

Abstract

PD-1H (Programmed death-1 homolog)는 T cell activation을 막기 때문에 매력적인 immunotherapy target이다. 어떻게 이런 기작을 하는지 밝혀지지는 않았는데, bioinformatic analysis를 통해서 PD-1H가 긴 IgV-like domain을 가지고, histidine 비율이 높다는 것이 밝혀졌다. 따라서 이러한 structural feature가 coinhibitory mechanism에 영향을 줄 것이라고 생각할 수 있다. 이 논문에서는 human PD-1H의 extracellular domain을 1.9Å 해상도의 crystal strucuture로 찍었다.

이 구조에서 elongate된 CC’ loop과 histidine residue의 비율이 높은 부분이 CDR과 같은 region에 있었고, surface-exposed histdine cluster가 T cell activation의 robustness에 영향이 있다는 것을 알아냈다.

PD-1H는 다른 IgV 구조에서는 볼 수 없는 extra “H” β-strand와 “clamping” disulfide 구조를 가졌다. 이것이 다른 IgV-like domain과는 다르게 cell surface의 orientation을 restrict했다. 이 논문이 VISTA의 T cell coinhibition의 molecular basis에 대한 insight를 줬다고 할 수 있다.

Introduction

• PD-1H can function as an inhibitory ligand on antigen-presenting cells and regulate T cell re- sponses, and ablation of PD-1H by either genetic knockout or antagonist antibody can boost T cell immune responses against tumors in mouse models

• PD-1H could also function as a coinhibitory receptor on T cells. PD-1H agonistic mAb dramatically regulates antigen-specific CD4 T cell responses and protects mice from GVHD, acute hepatitis, and asthma (9, 10, 15). Up-regulated PD-1H in prostate cancer patients was also shown to associate with resistance to ipilimumab (CTLA-4 mAb)
• PD-1H is considered homologous to both the T cell coinhibitory receptor PD-1 as well as the IgV-like domain of B7-H1 (PD-L1)

Results

PD-1H Has a Very Long IgV-Like Domain with a Unique CC′ Loop and Exceptional Histidine Content

일단 다른 논문에 따르면 총 279개의 amino acid가 있고, 162개가 extracellular domain, 21개가 transmembrane domain, 96개가 cytoplasm에 있다고 알려져 있는데, 일단 이 중에서 162개의 extracellular domain만 본다고 가정하자.

1. PD-1H를 다른 연관되어 있는 amino acid sequence인 CD28과 B7과 비교해 봤을 때 PD-1H가 CC’ region에 ~20개 이상의 unique한 region을 갖는데, 이를 CC’ loop이라고 부른다. 실제로 다른 IgV-like domain과 비교해 봤을 때도 sequence 자체가 significant하게 길다.

2. 또한 ECD (ExtraCellular Domain)부분에 histidine의 비율이 유의미하게 높다. 다른 type 1 transmembrane ECD와 비교했을 때 PD-1의 histidine 비율이 8.6%로, 다른 type의 비율인 2.4%보다 월등하게 높았다.

General Features of the PD-1H Crystal Structure

• Deglycosylation과 같은 어려운 과정을 거쳐서 crystal model을 만들었고, strucutresms IgV-like domain of PD-L1을 이용한 molecular replacement로 풀었다.

  • 이 때 1-26, 33-153까지는 풀었는데, 27-32번까지 (CDR1에 해당하는 부분) 는 disordered해서 제대로 보이지 않았다.

• Overall structure는 β-sandwich conformation을 가졌고, front face에는 H-, A-, G-, F-, C-, C’- 부분이, 뒤에는 A’-, B-, E-, D-, C’’- strand가 존재했다.

  • 일단 다른 IgSF member들과 마찬가지로 Cys22-Cys114 disulfide bridgind이 존재했고 (B-F strand bridging, locking front sheet to the back sheet), Trp40도 conserve 되어서 이 disulfide와 packing을 하면서 hydrophobic core를 형성한다.

    

  • 그 다음에 Asp-108의 main chain carbonyl oxygen과 Tyr-112번 사이에도 H-bond가 있었다.

    

  • 하지만 D-strand 앞에 있는 arginine과 B-strand 앞에 있는 aspartate와의 interaction이 존재하지 않았다. 그 대신 Arg58-Asp108의 interaction이 있다. 이는 특이하게 긴 CC’ loop으로 인해 생긴 것이다.

  • 또한 다른 B7 family member에서는 나타나는 disulfide bond가 없지만, 다른 두 개의 disulfide bond가 존재한다. (additional disulfide clamps the N-terminal A′-strand to the C-terminal H-strand, and another disulfide connects the CC′ loop to the F-strand)

  • However, PD-1H differs from these structures in having an additional α-helix between its C″- and D-strands, and even more strikingly in having an additional β-strand after the final G-strand that redirects the peptide chain such that it emerges from an unusual location closer to the N-terminal (CDR-equivalent) end of the ectodomain

PD-1H Has a Striking Spatial Concentration of Conserved Histidines and a Tethered CC ′ Protrusion

• Histidine residue의 경우에는 CDR-proximal half에만 전부 다 존재하고 나머지 half에는 아예 존재하지 않는다.
• 이렇게 됨으로써 membrane에서 떨어져 있게 되고, 다른 putative counterrreceptor과 interaction을 할 수 있다.

• Extended CC’ loop이 invariant한 disulfide bond (Cys51-Cys113)에 의해 IgV에 연결되어 있고, salt-bridge(Arg58-Asp108)도 이에 기여한다.
• 그리고 다른 경우에는 CC’ loop이 FG loop을 향해 가 있는데, PD-1H의 경우에는 stalk (membrane과 연결되는 부분)으로 뻗어있다.

Conserved Histidine Clusters on PD-1H Are Functionally Important

• Histidine있는 세 cluster를 alanine으로 바꿔보기도 하고, CC’ loop을 없애보기도 함.
  • CC’ loop을 없애는 건 inhibitory action이 감소되지 않음.
  • Histidine 없애는건 크게 감소됨.
  • 하나씩 없애도 감소하긴 하지만, 세 개 다 없애면 완전 감소 - histidine의 pH 민감도 때문에 중요?
  • Triple Histidine인 경우가 가장 inhibitory effect 감소됨.
• 근데 이미 있는 PD-1H recombinant monoclonal antibody 같은 경우에는 이에 영향받지 않음.. 이 말은 다른 중요한 factor가 있다는 것

PD-1H Deviates Profoundly from IgV-Like Topologies by a Tethered H β-Strand and a “Clamping” Disulfide That Enforce a Unique Point of Emergence for Its Stalk

• PD-H1의 길이가 다른 IgV domain 애들보다 긴데, 그 이유가 CC’ loop 때문도 있지만, G-strand 다음에 있는 또 다른 β-strand인 H-strand 때문도 있다.
• 다른 family들과 비교해봤을 때 이러한 H-strand가 stalk이나 transmembrane region에 locate 되어 있다.
  • 이것 때문에 cell surface에서의 orientation이 restriction 되어있다.
  • 대부분 N-terminal과 C-terminal이 반대에 위치해 있는데, PD-H1의 경우에는 같은 방향에 위치해 있다.
  • 원래는 H-strand가 long-disordered stalk이었는데, PD-H1의 경우에는 stalk자체가 되게 짧다.
  • 그렇기 때문에 counterpart와의 interaction을 더 잘할 수 있는 방향으로 align이 되어서 잘 interaction하는게 아닌가 싶다.

• 그래서 H-strand를 없애고도 test를 해봤는데, 세 가지 경우가 있었다.

  1. WT
  2. H-strand 만 없애고 H-strand 연결하는 연결 부위는 그대로 놔둔 경우
  3. H-strand도 없애고 disulfide bond도 삭제한 경우

  점점 cell proliferation이 높아지는 것을 (inhibit이 안됨) 볼 수 있었다. Expression level로 인한 차이는 아님.